Anforderungen an die Analytik von Cannabisblüten

Ein Apotheker gibt einen Überblick über nötige Prüfverfahren nach dem  europäischem und deutschem Arzneibuch

Ein Gastbeitrag von Adrian Pohl, Leitung der Qualitätssicherung bei QSI GmbH Bremen

Ich möchte etwas Licht ins Dunkle der Analytik von Cannabis bringen, da ich durch meine Erfahrung in der Branche gelernt habe, dass wenig gebündelte Informationen vorliegen, die verständlich erklären, was die gesetzlichen Anforderungen an die Qualität von Cannabis sind. Um den zeitlichen Rahmen nicht zu sprengen, konzentrieren wir uns heute zunächst einmal stellvertretend auf die Qualitätsanforderungen an Cannabisblüten. Für Cannabisextrakte sind die Anforderungen in der ph.Eur. Monographie Zubereitungen aus pflanzlichen Drogen und der DAB-Monographie Eingestellter Cannabisextrakt aufgeführt.

Ph.Eur. Monographie Pflanzliche Drogen

Definition

Auch wenn derzeit noch keine harmonisierte Monographie für Cannabisblüten im Europäischen Arzneibuch (Ph.Eur.) existiert, gelten die Anforderungen der Ph.Eur. Monographie für pflanzliche Drogen und diese sind dementsprechend bei der Analytik umzusetzen. Hierbei besagt die Definition, dass es sich bei pflanzlichen Drogen im Allgemeinen um unverarbeitete ganze, zerkleinerte oder zerbrochene Pflanzen oder Pflanzenteile handelt, welche gewöhnlich im getrockneten, manchmal auch in frischem Zustand verwendet werden. Genauere Beschreibungen der Morphologie finden sich hierbei in der Monographie des Deutschen Arzneibuchs (DAB) für Cannabisblüten. Jedoch werden wir auf die Vorgaben des DAB noch später umfassend eingehen. Befassen wir uns erst einmal mit den Anforderungen, die uns das Europäische Arzneibuch auferlegt. 

In Bezug auf Cannabisblüten spricht das Ph.Eur. von getrockneten pflanzlichen Drogen, welche frei von Erde, Staub, Schmutz und anderen Verunreinigungen, wie Pilzen, Insekten und sonstigen tierischen Verunreinigungen sein müssen und keine Anzeichen von Verderb aufweisen dürfen. Wird dabei ein Entkeimungsverfahren verwendet, muss sichergestellt sein, dass die Pflanzeninhaltsstoffe nicht verändert werden und keine schädlichen Rückstände in der Droge verbleiben. 

Reinheit

Bei der Prüfung auf Reinheit werden verschiedene Prüfungen durchgeführt. Als Erstes nennt hierbei das Ph.Eur. die Prüfung auf fremde Bestandteile, diese dürfen höchstens 2 % (m/m) betragen. Dabei werden 100 g Blüten auf einer geeigneten Fläche ausgebreitet und mit bloßem Auge oder mithilfe einer Lupe auf fremde Bestandteile untersucht. In den seltensten Fällen beobachten wir hierbei Abweichungen, da Medizinalcannabis unter strengsten GACP-Kriterien angebaut wird und somit keine Verunreinigungen vom typischen Ackeranbau anderer pflanzlicher Drogen enthält. 

Als weitere Prüfung schreibt das Ph.Eur. den Trocknungsverlust vor, welcher auch bei der späteren Berechnung des Cannabinoid-Gehalts eine Rolle spielt, um diesen auf eine vollständig getrocknete Droge zu normieren. 

Das Ph.Eur. schreibt außerdem in der der Monographie Pflanzliche Drogen die Prüfung auf Pestizid-Rückstände vor. Laut Definition im Sinne des Arzneibuchs sind Pestizide Substanzen oder Substanzgemische, die zur Abwehr, Vernichtung oder Bekämpfung von Schädlingen oder unerwünschten Pflanzen oder Tierarten dienen. Diese können schädlich sein für Patienten oder Patientinnen und daher wurden Grenzwerte für die gängigsten Pestizide definiert. Sofern Pestizide verwendet werden, die nicht im ph.Eur. aufgelistet sind, ist die Verordnung (EG) Nr. 396/2005 des Europäischen Parlaments und des Rates über Höchstgehalte an Pestizidrückständen in oder auf Lebens- und Futtermitteln pflanzlichen und tierischen Ursprungs inklusive aller dazugehörigen Anhänge als Quelle zu verwenden. Für die Analytik kommt Flüssigchromatographie und Gaschromatographie zum Einsatz.

Abgesehen von begründeten und zugelassenen Fällen wird eine Prüfung auf Schwermetalle durchgeführt mit Grenzwerten im Bereich von 0,1 – 5 Mikrogramm je Gramm pflanzliche Droge für Cadmium, Blei und Quecksilber. Falls es erforderlich sein sollte, können Grenzwerte für weitere Schwermetalle festgelegt werden. Als Methoden werden die Atomabsorptions- oder Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma genannt. 

Grundsätzlich beinhaltet die Monographie für pflanzliche Drogen auch eine Bestimmung der Asche und der salzsäureunlöslichen Asche. Mit dieser Methode können mineralische Verunreinigungen durch Anwendung von gravimetrischen Verfahren quantifiziert werden. In Bezug auf Cannabisblüten ist hierbei jedoch von keinem Risiko auszugehen und daher kann, mit angemessener Rechtfertigung, auf diese Prüfungen verzichtet werden. 

In Bezug auf den Umfang der Bestimmung von Aflatoxinen und Ochratoxin A muss im Rahmen einer Risikoanalyse entschieden werden, wie häufig Tests durchgeführt werden. Grundsätzlich sind Aflatoxine hoch toxisch und krebserregend. Sie sind natürlich vorkommende Pilzgifte, welche hauptsächlich von Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus gebildet werden. Ochratoxin A ist ebenfalls ein Pilzgift und wirkt nephrotoxisch und nephrokarzinogen. Als erstes wurde es dabei aus Aspergillus ochraceus isoliert und später in weiteren Aspergillus- und verschiedenen Penicillium-Arten nachgewiesen. Die Pilze können dabei, sofern anwesend, alle Arten von organischem Substrat besiedeln, wenn die richtigen Bedingungen, wie Feuchtigkeit und Wärme vorliegen.

Die Limits des ph.Eur. für Aflatoxine B1 liegen bei 2 Mikrogramm je Kilogramm und die zuständige Behörde kann auch für den Gesamtgehalt an Aflatoxin B1, B2, G1 und G2 einen Grenzwert von 4 Mikrogramm je Kilogramm pflanzliche Droge festlegen. Für Ochratoxin A dürfen maximal 20 Mikrogramm je Kilogramm enthalten sein. 

Die Methoden zur Bestimmung von Aflatoxinen und Ochratoxin A aus dem ph.Eur. wurden für andere pflanzliche Drogen als Cannabisblüten entwickelt und müssen daher einer Eignungsprüfung unterzogen werden, bevor die Ergebnisse als valide betrachtet werden können. Diese Eignungsprüfung liegt für Cannabisblüten selbstverständlich schon bei uns vor und es bedarf nur in seltenen Fällen einer produktspezifischen Verifizierung der Methode. Für die Analytik kommt es zum Einsatz von Flüssigchromatographie.

Als letztgenannte Prüfung des ph.Eur. wird die mikrobielle Verunreinigung aufgeführt. Die Mikroorganismen können sich potenziell schädlich auf Patienten und Patientinnen auswirken, daher müssen die Hersteller durch Anwendung der bestehenden GMP-Leitlinien bei der Lagerung, Herstellung und dem Inverkehrbringen eine niedrige mikrobielle Ausgangsbelastung in fertiggestellten Darreichungsformen gewährleisten. Hierbei werden vom ph.Eur. zwei Allgemeine Methoden genannt, welche Angaben zur Durchführung und den Akzeptanzkriterien enthalten. 

Diese basieren auf der Gesamtzahl aerober Mikroorganismen (TAMC), der Gesamtzahl an Hefen und Schimmelpilzen (TYMC), der Anzahl an gallensalztolerierenden gramnegativen Bakterien und der Abwesenheit von Escherichia coli und Salmonellen. Die jeweilige Anzahl an Mikroorgansimen wird vom ph.Eur. in verschiedenen Kategorien vorgegeben, welche durch bestimmte Akzeptanzkriterien definiert sind. 

Weitere Angaben zur Qualität von Cannabisblüten sind in den jeweiligen nationalen Monographien niedergeschrieben, wobei wir uns am Beispiel der deutschen Monographie orientieren. 

DAB-Monographie für Cannabisblüten

Definition DAB

Laut Definition der DAB-Monographie für Cannabisblüten bestehen diese aus ganzen oder zerkleinerten, blühenden, getrockneten Triebspitzen der weiblichen Pflanzen von Cannabis sativa. Dabei enthält die Droge mindestens 90,0 oder höchstens 110,0 Prozent der in der Beschriftung angegebenen Menge an Cannabinoiden, wie ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) und Cannabidiol (CBD) sowie deren Carbonsäuren ∆9-Tetrahydrocannabinolsäure (THCA) und Cannabidiolsäure (CBDA). Dabei wird stets der Gesamtgehalt an THC und CBD (Säuren + nicht-Säuren) zur Bewertung des Korridors zwischen 90,0 und 110,0 %, bezogen auf die getrocknete Droge, herangezogen. 

Um die Qualität von Cannabisblüten zu beurteilen, muss zunächst die Identität der Droge festgestellt werden. Hierbei werden drei verschiedene Prüfungen vorgeschrieben. 

Identität DAB

Bei der makroskopischen Prüfung werden charakteristische Merkmale der Cannabisblüten überprüft und die Morphologie der Blüten nach den Vorgaben der Monographie genauestens untersucht. Darauffolgend wird die pulverisierte Cannabisblüte mit Chloralhydrat-Lösung angefärbt und die mikroskopischen Merkmale werden überprüft. Hierbei wird u.a. auf Drüsenhaare, Deckhaare, Calciumoxalatdrusen, isolierte Köpfchen oder verdickte Zellwände geprüft, um nur einige nennen. 

Ein weiterer Teil der Prüfung auf Identität ist die Prüfung mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (DC). Hierbei wird die Droge mit Methanol extrahiert, filtriert und neben einer Referenzlösung von THCA und CBD auf einer DC-Platte aufgetragen. Wird diese nun in ein Fließmittel gestellt, wird die Flüssigkeit durch die Kapillarkräfte von der Platte aufgenommen und die Analyten beginnen, auf dieser nach oben zu wandern. Je nachdem wie stark die Wechselwirkungen mit der Platte oder mit dem Fließmittel sind, wandern die enthaltenen Cannabinoide eine charakteristische Strecke. Anschließend wird die Platte mit einem Farbreagenz besprüht und erhitzt. Durch den Vergleich mit der Referenz wird es so ermöglicht THCA sowie CBD und daraus resultierend auch Cannabisblüten zu identifizieren.

Reinheit DAB

Bei der Prüfung auf Reinheit nach den Vorgaben der DAB Monographie für Cannabisblüten wird, ebenso wie in der ph. Eur. Monographie für pflanzliche Drogen, die Anforderung zur Prüfung auf fremde Bestandteile gestellt, wobei der Maximalwert von 2 % (m/m) identisch mit dem aus dem ph.Eur. ist. Auch der Trocknungsverlust wird nochmal explizit vom DAB als durchzuführende Prüfung angegeben, doch an dieser Stelle wird die zu verwendende Methode noch genauer spezifiziert. Die Droge wird dabei in einem Zeitraum von 24 Stunden unter definiertem Druck im Vakuumtrockenschrank getrocknet und der Masseverlust nach der Trocknung bestimmt. Die Grenze von 10 % Trocknungsverlust ist dabei in beiden Monographien identisch. 

Als weitere Anforderung an die Reinheit von Cannabisblüten wird die Prüfung auf Cannabinol (CBN) genannt. Die Verunreinigung darf max. 1,0 % betragen und wird mit Hilfe der Flüssigchromatographie bestimmt. Die Reinheitsprüfung wird zusammen mit der Gehaltsbestimmung in einer Analysesequenz durchgeführt, da sich die Methode lediglich um die Verwendung der jeweiligen Cannabinoid-Referenzsubstanzen unterscheidet. 

Gehalt DAB

Kommen wir zum wohl spannendsten Teil der DAB-Monographie, nämlich der Gehaltsbestimmung. 

Wie eben schon erwähnt kommt bei dieser die Flüssigchromatographie zum Einsatz. Für die Bestimmung werden die Cannabinoide aus der pulverisierten Droge mit Ethanol in mehreren Schritten extrahiert und der Extrakt durch einen Membranfilter filtriert. 

Anschließend werden 5 Referenzlösungen mit jeweils 6 unterschiedlichen Konzentrationsniveaus hergestellt, um spezifische Arbeitsbereiche zu schaffen, in denen die Cannabinoide genau quantifiziert werden können. In diesen 5 Referenzlösungen sind THC, THCA, CBD, CBDA und CBN jeweils einzeln enthalten. Eine weitere Referenzlösung enthält eine Mischung aus THC und ∆8-THC und dient einer späteren Eignungsprüfung der Chromatographie, ob die analytischen Signale ausreichend voneinander getrennt sind.

Um die einzelnen Cannabinoide aus den jeweiligen Proben nun voneinander zu trennen, werden die zuvor hergestellten ethanolischen Extrakte in das chromatographische System injiziert und bewegen sich in einem Lösungsmittelgemisch entlang einer festen, porösen Phase (s.g. Säule, stationäre Phase). Je nachdem mit welcher Affinität sich ein Cannabinoid abwechselnd im Lösungsmittelgemisch oder an der Oberfläche der Säule aufhält, entstehen Unterschiede in der Zeit, die der jeweilige Stoff benötigt, um das chromatische System zu durchqueren. 

Dies bezeichnet man als Retentionszeit, welche für jedes Cannabinoid charakteristisch ist und somit ermöglicht jenes anhand dieses Merkmals zu identifizieren. Zusätzlich injiziert man die jeweiligen Referenzlösungen und vergleicht die Retentionszeiten miteinander, um zu wissen zu welcher Zeit, welches Cannabinoid das chromatische System verlässt und an einen Detektor ein Signal erzeugt. 

Um nun nicht nur eine qualitative Aussage über die Anwesenheit von beispielsweise THC in einer Probe treffen zu können und genau die Konzentration des Cannabinoids zu quantifizieren, wird zu den jeweiligen Retentionszeiten bestimmt, wie groß die Flächen der spezifischen Signale (s.g. Peakflächen) sind und diese Peakflächen werden mit denen der Referenzlösungen, bekannter Konzentration, abgeglichen. Wenn man also die Konzentration in der Referenzlösung kennt und weiß, wie groß das Signal dazu ist, kann man davon ausgehend, ein Signal zu einem Cannabinoid in einer Probe in eine Konzentration umrechnen. Die Formeln für die anschließende Angabe der Cannabinoid-Gehalte werden vom DAB vorgegeben. 

Des Weiteren werden keine Prüfungen mehr von der Monographie des deutschen Arzneibuchs erwähnt und es folgen lediglich Angaben zur Lagerung und allgemeine Hinweise zu Produktgruppen von Cannabisblüten. Es ist außerdem ein Vermerk zur Beschriftung der Behältnisse angegeben, dass auf diesen der berechnete Prozentgehalt von THC und CBD angegeben werden muss. 

Schlusswort

Abschließend hoffe ich einen verständlichen Überblick über die Anforderungen an die Qualität von Cannabisblüten nach den Vorgaben des europäischen und deutschen Arzneibuchs gegeben zu haben und freue mich auf die blumige Zukunft unserer florierenden Branche. Gerade in Bezug auf die Qualitätskontrolle sind wir sehr gespannt, was der Gesetzgeber für Anforderungen an zukünftige Genussmittel-Produkte stellen könnte; wir sind jedoch bestens auf alles vorbereitet. 

Über den Autor

Adrian Pohl ist von Beruf Apotheker und arbeitet bei der QSI GmbH in Bremen als Leiter der Qualitätssicherung. Das Labor ist Teil der Tentamus Laborgruppe, welche mittlerweile mit 85 Laboren auf fast allen Kontinenten vertreten ist, wobei sich der Standort in der Hansestadt Bremen auf die Analytik von Nutzhanf, hanfhaltigen Lebensmitteln, CBD-Extrakten und -Isolat sowie der ganzen Bandbreite von betäubungsmittelpflichtigen Cannabisarzneimitteln, wie Cannabisblüten, -extrakten, Dronabinol und die Durchführung von Stabilitätsuntersuchungen spezialisiert hat. Das Unternehmen verfügt über die betäubungsmittelrechtliche Erlaubnis nach § 3 BtMG, eine GMP-Zertifizierung, eine DAkkS-Akkreditierung und zudem eine Herstellungserlaubnis nach § 13 AMG. 

Adrians Arbeit bezieht sich dabei auf die Einhaltung der GMP-Regeln und der nationalen, arzneimittelrechtlichen Anforderungen an das Labor, die Betreuung von Großprojekten im GMP-Umfeld, sowie die Verbandsarbeit u.a. im Bereich der Genussmittelregulierung – natürlich befürwortet Adrian eine regulierte Abgabe zu Genussmittelzwecken. Sie möchten sich mit Adrian austauschen? Adrian und seine Kollegen sind für QSI ist auf der ICBC 2022 in Berlin vertreten. 

Adrian Pohl ist auch auf der ICBC 2022 in Berlin am 19. und 20. Juli. krautinvest.de ist Medienpartner der ICBC.